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HumanUmbilical Cord Mesenchymal-Stem-Cell-Derived Extracellular Vesicles Reduce Skin Inflammation In Vitro
人類臍帶間充質幹細胞衍生的細胞外囊泡(UC-MSC-EVs)在體外減少皮膚炎症文獻來源：https://www.mdpi.com/1422-0067/24/23/17109
摘要
本研究探討了來自人類臍帶間充質幹細胞（UC-MSCs）衍生的細胞外囊泡，對於氧化噻唑啉（oxazolone）誘導的傷害，在永生化人類角質形成細胞系HaCaT中的保護作用。細胞在氧化噻唑啉暴露前24小時，預處理了UC-MSC衍生的細胞外囊泡（EVs）或未處理。與僅接受直接氧化噻唑啉處理的細胞相比，預處理的UC-MSC-EVs顯示出保護活性，提升了細胞活力，降低了細胞內活性氧（ROS）水平，並減少了線粒體膜電位的變化。UC-MSC-EVs還透過降低促炎細胞因子IL-1和TNF-α的表現，來展現抗炎活性。
機制研究顯示，UC-MSC-EVs增加了SIRT1和P53的蛋白質表達水平，並降低了P65的蛋白質表達。結論認為，UC-MSC-EVs能夠誘導HaCaT細胞的抗氧化防禦系統，並可能作為抗衰老化妝品中的功能成分，具有護膚潛力。
外泌體在 HaCaT 細胞中的內化：共聚焦顯微鏡下的時空定位分析
本篇文獻探討了來源於人類臍帶間充質幹細胞（UC-MSCs）的細胞外囊泡（EVs）在減少皮膚炎症方面的治療潛力。以下是該研究可能涵蓋的一般概述：
主要組成部分：
- 什麼是間充質幹細胞（MSCs）：這是一種存在於多種組織中的多潛能幹細胞，包括臍帶。它們以調節免疫反應、促進組織再生和釋放生物活性分子而著稱。
- 什麼是細胞外囊泡（EVs）：EVs 是細胞釋放的小型膜包裹顆粒，攜帶蛋白質、脂質和 RNA。它們在細胞間的通信中扮演著重要角色，並且能夠介導 MSC 對靶細胞的影響。
- 什麼是皮膚炎症：皮膚炎症可能由多種因素引起，包括損傷、感染和自身免疫疾病。它通常涉及免疫細胞的激活、促炎細胞因子的釋放以及皮膚屏障功能的改變。
研究結果：
- EV的分離：研究將詳細描述用於從UC-MSCs中分離EV的方法，通常涉及超離心或其他純化技術。
- 體外模型：研究人員可能使用角質形成細胞或其他皮膚細胞系來模擬皮膚炎症。可能使用炎症刺激物，如脂多醣（LPS）或細胞因子，來誘導這些細胞的炎症反應。
- EV治療的效果：研究將評估用UC-MSC衍生的EV治療，如何影響炎症標記物、細胞活力以及參與炎症的細胞因子和其他介質的表達。
- 作用機制：研究人員將探討EV如何發揮其抗炎作用的潛在機制，可能涉及微RNA、蛋白質或其他分子的轉移，這些分子能調節細胞反應。
影響：
這類研究的結果，可能對開發新的皮膚炎症治療方法具有重要意義，提供一種傳統抗炎藥物的潛在替代方案。使用UC-MSC衍生的EV，可能因其再生特性和低免疫原性，而提供更安全和更有效的治療選擇。
1. 引言
皮膚科醫學涵蓋了廣泛的皮膚疾病，包括牛皮癬、濕疹、特應性皮炎、扁平苔癬、膨疹性皮膚病、系統性紅斑狼瘡以及慢性傷口癒合等。這是一個多學科的領域，旨在恢復皮膚在創傷、衰老或疾病情況下的功能。最近的研究顯示，來自脂肪間充質幹細胞（MSC）的細胞外囊泡（EVs）對小鼠皮膚傷口模型具有有益的效果。這些EVs幫助促進慢性傷口癒合，通過調節炎症反應、加強傷口癒合機制以及限制瘢痕形成。EVs誘導傷口癒合的確切機制仍然未知【1–3】。
EVs天然具有非免疫原性，因為它們包含細胞分泌的顆粒，能夠促進細胞內的相互作用。由於其固有的安全性，EVs成為創新療法的絕佳選擇【4,5】。我們的先前研究顯示，來自臍帶間充質幹細胞（UC-MSCs）釋放的EVs抑制了肥大細胞的活化，減少了促炎細胞因子的產生，並幫助管理過敏性疾病【6】。目前的評論報導指出，EVs介導了MSC的功能，例如免疫調節、組織修復和穩態恢復【7】。加速皮膚的傷口修復，在困難的傷口疾病、和術後修復中具有重要的臨床意義【8】。還需要進一步的研究，以揭示基於EV的療法在傷口管理中的潛在機制。
氧化壓力通過與活性氧（ROS）相關的途徑引起細胞皮膚炎症和衰老，包括靜默信息調節因子1（Sirtuin 1，SIRT1）/叉頭盒O（FOXO）信號通路、核因子κB（NF-κB）信號通路以及p53相關通路【9】。Sirtuins因其在控制與衰老相關的靶標和延長人類壽命方面的作用而成為研究的焦點【10】。SIRT1是人類sirtuin同種型之一，是一種依賴NAD⁺的蛋白去乙酰化酶，具有廣泛的底物範圍，包括重要的核蛋白p53和FOXO3【11】。最近的研究顯示，SIRT1作為多功能轉錄因子，可以調節各種生理病理過程，包括上皮再生【12】。SIRT1通過去乙酰化NF-κB來調節免疫反應，從而降低NF-κB的活性【13】。NF-κB級聯反應可以激活和調節IL-6和TNF-α等炎症因子。這些因子可以作為NF-κB的新激活因子，形成促炎信號的正反饋機制。值得注意的是，NF-κB信號的激活會促進細胞衰老【14】，而阻止NF-κB通路可以延長果蠅和小鼠的壽命【15】。
p53是在有害條件下調節細胞週期和基因完整性的關鍵蛋白。它通過確保受損細胞得到修復或被消除，來維持皮膚的穩態，從而保持表皮的完整性。SIRT1去乙酰化p53，抑制其轉活化能力並抑制轉錄【16】。我們評估了SIRT1、p53和NF-κB在皮膚損傷發展中的參與情況，並評估了UC-MSC-EVs對角質形成細胞的有益效果。在p53響應基因中，叉頭盒O3（FOXO3）轉錄因子吸引了我們的注意，因為它們控制與抗氧化壓力和抗衰老相關的基因表達【17,18】。FOXO3是p53的靶基因，p53作為FOXO3基因上游的直接轉錄激活因子【19】。這兩個轉錄因子，對於控制長壽和腫瘤抑制至關重要。然而，EVs調節細胞反應的機制尚未被充分研究。本研究旨在闡明UC-MSC-EVs作為製藥和化妝品領域中功能性皮膚產品再生和修復的原材料的潛力。
2. 結果
2.1 UC-MSCs來源的EVs顯示出外泌體特徵
使用透射電子顯微鏡（TEM）和納米粒徑分析（NTA）觀察UC-MSC-EVs的形狀和尺寸分佈。粒徑分析的結果確認，粒徑的主要峰值在細胞外囊泡的典型尺寸範圍內（30–150 nm）。根據NTA結果，細胞外囊泡的直徑約為103.3 ± 1.0 nm（圖1a）。TEM特別適用於表徵細胞外囊泡的內容物，且優勢在於不需要標記。TEM顯示，UC-MSC-EVs由球形雙膜包裹的囊泡組成（圖1b），並根據免疫化學流式細胞儀分析，呈現外泌體陽性標記物CD9、CD63和CD81（圖1c）。
2.2 UC-MSC-EV治療下的HaCaT細胞存活率
我們首先使用MTS測定法評估UC-MSC-EVs對HaCaT細胞的生長影響。在暴露於氧化噻唑啉之前，向HaCaT細胞添加了總數量範圍為1×10^8（相當於1 µg/mL總蛋白質）至1×10^10/mL（相當於100 µg/mL總蛋白質）的UC-MSC-EVs。與空白對照相比，經過24小時的氧化噻唑啉暴露後，未觀察到顯著的細胞毒性，這表明低劑量的氧化噻唑啉適合用於研究角質形成細胞刺激的長期影響。每劑量的UC-MSC-EVs對HaCaT細胞的活力也沒有影響（圖2）。
外泌體尺寸範圍及標誌物表達特徵全面分析：
圖1.UCMSC-EVs 的特性：
- (a) NTA 分析顯示外泌體的直徑範圍為 55 至 145 nm，平均直徑為 108.3 ± 1.9 nm。
- (b) 透射電子顯微鏡顯示 UCMSC-EVs 的形態代表圖。比例尺 = 50 nm。
- (c) 外泌體標誌物 (CD9、CD63 和 CD81) 的表達使用流式細胞儀檢測。
圖2.不同劑量的UCMSC-EVs對細胞活力的影響：
2.3 UC-MSC-EVs 加速細胞遷移
為了探討UC-MSC-EVs在細胞遷移活動中的作用，培養的HaCaT細胞在處理1小時的美托霉素（mitomycin）以抑制細胞增殖後，記錄了24小時的刮痕間隙。刮痕傷口測試顯示，UC-MSC-EVs導致細胞遷移顯著增加，相較於對照組（圖3）。這些結果表明，UC-MSC-EVs可能通過加速HaCaT細胞的遷移來促進皮膚傷口癒合。
外泌體促進細胞遷移：UCMSC-EVs 在 HaCaT 細胞中的功效與時間依賴性分析
2.4 UC-MSC-EVs在HaCaT細胞中的保留
我們通過跟蹤螢光標記的EVs來檢測UC-MSC-EVs在細胞中的保留；在4小時時，在HaCaT細胞的細胞質和核周區域觀察到綠色信號。經過1天後，UC-MSC-EVs在核區域的密度顯著增加（圖4）。在第3天，HaCaT細胞的核內顯示出斑點狀的染色模式。結果表明，移植的UC-MSC-EVs可以被細胞吸收，並能穿透並在細胞核中積累。
為了進一步探討UC-MSC-EVs在細胞遷移中的作用，我們培養的HaCaT細胞在接受氧化噻唑啉處理之前，測量了細胞內和線粒體區域的活性氧（ROS）水平。使用與細胞中各種ROS反應的DCFDA探針，我們在氧化噻唑啉處理後檢測到細胞內ROS水平顯著升高，並使用專門針對線粒體的MitoSox探針檢測到線粒體超氧化物的相應增加（圖5）。接下來，我們檢查了UC-MSC-EVs對角質形成細胞是否顯示出抗氧化益處。UC-MSC-EVs的添加有效減少了內源性ROS水平，較對照組降低了30%。應用1×10^8至1×10^10顆粒/mL的EVs顯示出清除ROS的劑量反應效應。此外，氧化噻唑啉處理導致的線粒體ROS生成增加了超過1.7倍，且在UC-MSC-EV預處理的細胞中，線粒體ROS水平以劑量依賴的方式降低，相較於僅接受氧化噻唑啉處理的細胞，雖然下調的幅度不如細胞質中的ROS顯著。表1顯示，氧化噻唑啉導致IL-1β和TNF-α的劇烈增加；相反，UC-MSC-EVs的預處理顯著降低了氧化噻唑啉誘導的促炎細胞因子的表達。
2.5 UC-MSC-EVs對ROS水平的影響
使用DCFDA探針測量細胞內和線粒體區域的活性氧（ROS）水平。我們發現，經氧化噻唑啉處理後，細胞內的ROS水平顯著升高，同時使用專門針對線粒體的MitoSox探針檢測到線粒體超氧化物的相應增加（圖5）。接下來，我們檢查了UC-MSC-EVs是否對角質形成細胞顯示出抗氧化益處。UC-MSC-EVs的添加有效降低了內源性ROS水平，較對照組降低了30%。應用1×10^8至1×10^10顆粒/mL的EVs顯示出清除ROS的劑量反應效應。
外泌體劑量依賴性抑制氧化氮誘導ROS的效果
外泌體預處理對促炎細胞因子表達的調節
此外，氧化噻唑啉處理導致的線粒體ROS生成超過1.7倍，且在UC-MSC-EV預處理的細胞中，線粒體ROS水平以劑量依賴的方式降低，與僅接受氧化噻唑啉處理的細胞相比，儘管下調的幅度不如細胞質中的ROS顯著。表1顯示，氧化噻唑啉導致IL-1β和TNF-α的劇烈增加；相反，UC-MSC-EVs的預處理顯著減少了氧化噻唑啉誘導的促炎細胞因子的表達。
外泌體對氧化氮處理下細胞因子水平的影響
5. 結論
我們從臍帶間充質幹細胞（UCMSCs）中分離了細胞外囊泡（EVs），並觀察到人類UCMSC-EVs被HaCaT細胞吸收。這些結果顯示，UCMSC-EVs在消除由氧化噻唑啉引起的角質形成細胞炎症狀態方面具有很高的潛力，具體機制包括上調SIRT1表達、增強P53表達、下調NF-κB蛋白水平以及消除ROS積累。我們注意到P53與FOXO3啟動子的結合增強，是UCMSC-EVs調節作用的基礎。
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