外泌體如何促傷口癒合與再生（脂肪幹細胞分泌的外泌體）

1. 引言

外泌體是大小為100納米到200納米的納米級細胞外囊泡（EVs），由大多數細胞自然分泌，以促進細胞間的通訊，通過將遺傳物質和分子材料運送到鄰近的細胞和組織中。外泌體的特徵和性質在以往的文獻中得到了廣泛的描述；簡而言之，這些奈米囊泡被廣泛認為富含蛋白質、脂質和核酸，作為細胞和組織中關鍵生物過程的主要介質，通過細胞內信號傳遞機制發揮作用。雖然外泌體的完整特徵和功能尚待闡明，但國際細胞外囊泡學會（ISEV）的合作努力，已經概述了其在許多非臨床和臨床環境中應用的最低要求，包括細胞自由療法和先進的傷口護理的定義、分離、特徵化、生產和儲存條件。

外泌體是通過各種純化方法，從細胞培養的分泌物中純化的，這些方法通常包括大小排斥色譜法、超高速離心、密度梯度過濾、切向流過濾和親和色譜法。之前的研究顯示，所分離的囊泡，具有與其來源細胞類型相關的治療特性，例如樹突細胞、間充質幹細胞（MSCs）、脂肪來源幹細胞和多能幹細胞。報導顯示，MSCs來源的外泌體在傷口癒合的各個階段中都有貢獻，包括促進快速重新上皮化、促進膠原蛋白成熟，以及由於其父母細胞的促血管生成和抗炎特性，而減少急性皮膚傷口的瘢痕形成【8,9】。類似地，脂肪組織來源的間充質幹細胞/基質細胞來源的外泌體（ASC-EXOs）也參與了通過調節炎症、血管生成和細胞外基質（ECM）重建，來促進組織再生和傷口癒合【10-12】。最重要的是，MSCs和ASC來源的外泌體，似乎繼承了與其父母幹細胞相似的旁分泌效應，例如免疫調節【13,14】，而無需細胞移植所帶來的相關風險，這對臨床使用非常有利【10】。

我們之前的研究表明，ASC-EXOs通過誘導神經酰胺的去新合成促進了異位性皮膚炎的表皮屏障修復。此外，我們報告了ASC-EXOs作為局部治療時的安全毒理學特徵，包括對皮膚敏感、光敏感、眼部和皮膚刺激以及急性口服毒性【15,16】。基於之前研究中，間充質幹細胞外泌體，在皮膚傷口癒合中的良好結果，我們旨在通過將其與一種常用的生物材料結合來進一步增強其效果。透明質酸（HA）是一種非硫酸化的糖胺聚糖，並且是皮膚ECM的主要成分，因其在傷口癒合、和再生中的寶貴特性而廣為人知。這些特性包括:高度的細胞相容性、保濕、抗衰老、良好的細胞相互作用和CD44靶向，使其成為傷口敷料和真皮填充劑的常用生物材料【17-19】。

因此，在本研究中，我們調查了ASC-EXOs與HA的結合效果。我們在體外研究了ASC-EXOs對人類真皮成纖維細胞（HDFs）的影響，以及它們在小鼠真皮填充模型中的組合效果。此外，我們還在豬傷口癒合模型中研究了其組合效果。值得注意的是，涉及外泌體的大多數體內研究，都是在急性皮膚傷口的啮齒動物模型中進行的，這些模型在解剖學、生理學和組織再生方面與人類皮膚存在顯著差異【20-22】。因此，我們選擇豬模型來提供對傷口癒合影響的更臨床相關的評估

2. 結果

2.1 ASC-EXOs在人體真皮成纖維細胞（HDFs）中的作用

在HDFs中進行了ASC-EXOs的體外評估，以評估其對細胞增殖、遷移和細胞外基質（ECM）重塑的潛在影響。ASC-EXOs以劑量依賴的方式增加了HDF細胞增殖，相較於對照組，ASC-EXO組的總增殖平均增加了120%（圖1A），顯示其對細胞增殖的刺激作用。刮痕傷口測試顯示，與負對照相比，ASC-EXOs促進了HDFs向無細胞區域的遷移（圖1B和圖C）。這些結果表明，ASC-EXOs加速傷口閉合，這部分是通過促進皮膚細胞在傷口癒合過程中的增殖來實現的。

ASC-EXOs還誘導了膠原蛋白、平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、成纖維細胞生長因子2（FGF2）和彈性蛋白等基因的mRNA表達水平上調，這些基因已知與皮膚中的細胞增殖和傷口癒合有關（圖1D）。此外，在ASC-EXOs治療下，HDFs中的膠原蛋白產量顯著增加，且隨濃度的增加而增強（圖1E）。綜合這些結果，表明ASC-EXOs對HDFs中的細胞增殖、遷移和與傷口癒合相關的基因表達具有有益影響，並且在傷口癒合和皮膚修復的背景下，它們可能有潛力加速傷口閉合和促進組織再生。

圖1. ASC-EXO 對 HDF 增殖、遷移和膠原蛋白合成的影響：

• (A)HDFs 分別以低濃度 (3 × 10⁹ 顆粒/mL) 和高濃度 (1.5 × 10¹⁰ 顆粒/mL) 的 ASC-EXO 或陽性對照處理 24 小時。通過 CCK-8 檢測確定細胞增殖率。
• (B)將 96 孔板中達到 100% 匯合的 HDFs 劃傷，並在 0 小時和 24 小時拍攝遷移結果。紫色區域表示細胞覆蓋區域。
• (C)劃痕傷口檢測的恢復率以百分比閉合率表示。
• (D)HDFs 經 ASC-EXO 處理 24 小時後，通過與 GADPH 水平的歸一化，分析編碼 I 型和 III 型膠原蛋白、α-SMA、FGF2 和彈性蛋白 (ELN) 的基因 mRNA 表達水平。
• (E)在 HDFs 中經 ASC-EXO 處理 24 小時後，測定 I 型前膠原 C-肽的濃度。

數據顯示為平均值 ± 標準差 (SD) (n = 3)，顯著性標記為 * p＜0.05, ** p＜0.01, *** p＜0.001, **** p＜0.0001。

2.2 HA與ASC-EXOs聯合使用對豬傷口癒合模型的影響

在豬皮膚的八個不同部位生成了長寬各30毫米的標準傷口切除，作為觀察和分析的交叉截面（圖2A）。對豬皮膚傷口進行了HA與ASC-EXOs的聯合外用處理，或僅使用聯合HA。外用給藥每週進行三次，於不同時間點收集皮膚組織，並在3週的研究結束時進行分析（圖2B）。

如圖2C和圖2D所示，使用HA與ASC-EXOs的聯合外用治療相比僅使用聯合HA的處理，在豬皮膚傷口的傷口閉合率上有所提高。儘管閉合率的變異性較大，ASC-EXO + HA組的傷口閉合率比僅HA組高出約10%（圖2C和圖2D）。經過血紅素-伊紅（H&E）染色的組織切片的組織學檢查顯示，使用HA與ASC-EXOs聯合治療的傷口相比僅使用聯合HA的部位在再上皮化方面顯著增加（圖2E和圖2F）。

圖2.ASC-EXO 對豬急性傷口癒合模型中傷口閉合和上皮再形成的影響：

• (A)示意圖描繪了特定無病原體 (SPF) 小型豬的皮膚傷口和局部治療。
• (B)傷口建模、局部治療和組織採集的時間表。
• (C)HA 和 ASC-EXO 合併治療 (ASC-EXO + HA) 與單獨使用 HA 治療的傷口閉合率比較。
• (D)第 7、14、17 和 19 天每次治療時傷口部位的代表性圖像。
• (E)皮膚組織切片的組織學檢查，使用蘇木精和伊紅（H&E）染色，顯示上皮再形成 (Re)、炎症 (In) 和肉芽組織 (Gn)。每個部分的放大影像顯示在右側面板中，對應於左側面板中的方框區域。
• (F)上皮化評分 (0–3) 的量化，顯示組織修復情況。比例尺代表 1 毫米。

數據顯示為平均值 ± SD (n = 4)，顯著性為 p < 0.01。

2.2 HA與ASC-EXOs的聯合治療在豬傷口癒合模型中的效果

為了進一步支持這些發現，進行了一個延長實驗，觀察期為5週。在此案例中，在兩個豬模型的六個不同部位生成了標準傷口切除，以減少選擇偏見並進行更好的比較（圖3A）。類似地，外用治療每週進行三次，並在每週評估傷口閉合，並在研究結束時進行皮膚組織收集以進行組織學檢查（圖3B）。如圖3C和圖3D所示，HA和外泌體（ASC-EXOs）的聯合治療在第11天和第14天的傷口閉合上顯著高於僅使用HA的組別。

這一差異也在與僅使用HA的傷口相比時，聯合治療組在再上皮化方面顯示出統計學上顯著的增加（圖3E和圖3F）。此外，聯合治療組在炎症反應上顯示出明顯減少，與僅使用HA的組別相比（圖3E）。雖然HA和ASC-EXOs的聯合治療並未增加I型膠原蛋白和膠原纖維，但有趣的是，在接受聯合治療的傷口部位中，膠原蛋白III的含量高於僅使用HA的組別（圖3G和圖3H），這表明聯合治療組在膠原沉積和組織重塑上有改善。

總的來說，這些結果表明，在豬傷口癒合模型中，HA和外泌體（ASC-EXOs）的聯合治療顯著提高了傷口閉合、再上皮化和膠原蛋白III的水平，顯示出外泌體（ASC-EXOs）在傷口癒合中，通過改善膠原沉積和組織重塑的潛在有益效果。

圖3.ASC-EXO 對延長的豬急性傷口癒合模型中傷口閉合、上皮再形成和膠原合成的影響。

• (A) 示意圖描繪了兩隻 SPF 小型豬的皮膚傷口和局部治療。
• (B) 傷口建模、局部治療和組織採集的時間表。
• (C) HA 和 ASC-EXO 合併治療 (ASC-EXO + HA) 與單獨使用 HA 治療的傷口閉合率比較。
• (D) 第 7、11、14、21、28 和 35 天每次治療時傷口部位的代表性圖像。
• (E) 皮膚組織切片的組織學檢查，使用（H&E）染色，顯示上皮再形成 (Re)、炎症 (In) 和肉芽組織 (Gn)。每個部分的放大影像顯示在右側面板中，對應於左側面板中的方框區域。比例尺代表 1 毫米。
• (F) 上皮化評分 (0–3) 的量化，顯示組織修復情況。
• (G) 組織切片使用 Masson’s trichrome 染色以顯示膠原纖維，並使用免疫組織化學 (IHC) 染色以顯示 I 型和 III 型膠原蛋白。箭頭表示剩餘疤痕的邊緣。每個部分的放大影像顯示在右側面板中（比例尺：200 μm），對應於左側面板中的方框區域（比例尺：2000 μm）。
• (H) 染色組織區域的量化顯示膠原纖維、I 型膠原和 III 型膠原的表現。圖表中的數據顯示為平均值 ± SD (n = 6)，顯著性為 * p＜0.05、** p＜0.01 和 *** p＜0.001。

2.3 HA與ASC-EXOs的聯合治療在小鼠皮膚填充模型中的效果

為了評估ASC-EXOs對小鼠皮膚的生物學效果，在無胸腺小鼠皮膚填充模型中進行了研究。將HA與ASC-EXOs的組合或僅HA在四個SKH1無毛小鼠的背部皮下注射，並在3週後收集移植組織以進行組織學分析（圖4A和圖4B）。值得注意的是，使用HA和ASC-EXOs聯合治療的組織顯示出更厚的組織層和增加的血管化，相較於僅注射HA的部位（圖4B）。H&E染色顯示，聯合治療組的細胞滲透率幾乎是僅HA組的兩倍（圖4C）。

Masson三色染色進一步顯示，聯合治療的組織中膠原纖維的數量較僅HA組明顯增加（圖4D）。IHC染色的膠原蛋白I和III的表達結果與豬傷口癒合模型一致，顯示聯合治療組的膠原蛋白III表達更高，而膠原蛋白I則未顯示統計學上的顯著性（圖4E和圖4F）。此外，對移植組織進行了免疫熒光（IF）染色，以檢查成纖維細胞的分化。結果顯示，HA與ASC-EXOs的聯合治療增加了vimentin陽性細胞和α-SMA陽性細胞的數量，相較於僅HA組，顯示出約兩倍的肌成纖維細胞滲透率。此外，vimentin與α-SMA的染色合併顯示，大部分vimentin陽性細胞表達α-SMA，而聯合治療組的α-SMA陽性細胞與vimentin陽性細胞的比例顯著高於僅HA組，這表明在肌成纖維細胞的分化上有所增強（圖4G）。

總體而言，這些結果表明，ASC-EXOs可能通過增加肌成纖維細胞的滲透和分化，並誘導細胞外基質的重塑，來促進小鼠皮膚填充模型中的組織再生。

圖4.ASC-EXO 對小鼠皮膚填充模型中組織再生的影響：

• (A) 示意圖顯示在 SKH1 無毛小鼠背部進行 HA 或 ASC-EXO + HA 的皮下注射（6 週齡，n = 4）。
• (B) 注射後 3 週，取出的組織移植的代表性圖像。
• (C) 使用（H&E）染色對移植物進行組織學評估，並在注射後 3 週定量滲透細胞。數據以平均值 ± 標準差 (SD) 顯示，顯著性為 **p＜0.01**。
• (D) 使用 Masson 三色染色可視化膠原纖維，藍色染色，並進行膠原蛋白 I 型 (E) 和 III 型 (F) 的 IHC 染色。
• 數據從每個切片的三個不同區域收集，以平均值 ± 標準誤 (SEM) 顯示，顯著性為 *p＜0.05* 和 **p＜0.01**。
• （C、D）的比例尺為 50 µm。
• (G) 對移植物進行組織學評估，以檢測 α-SMA 和波形蛋白的表達。顯示代表性的免疫熒光（IF）圖像，並在每個組織切片的三個不同區域定量 α-SMA 陽性或/和波形蛋白陽性細胞。

數據以平均值 ± SEM 顯示，顯著性為 *p＜0.05* 和 ***p＜0.001**。比例尺對於 20× 和 40× 放大圖像分別為 50 µm 和 20 µm。

3. 討論

本研究探討了ASC-EXOs對傷口癒合和組織再生的影響，包括體外和體內的實驗。ASC-EXOs無論是單獨使用還是與HA結合使用，均顯示出對細胞增殖、遷移和細胞外基質（ECM）重塑的積極影響，並在豬和小鼠模型中增強了傷口閉合和組織再生。ASC-EXOs的處理增加了細胞增殖、上調了與傷口癒合相關的基因表達，並增加了HDFs中的膠原蛋白產生，這表明它們具有促進ECM重塑的潛力。

透明質酸（HA）作為皮膚ECM的重要成分，以其在炎症調節、促進血管生成和組織再生等方面的寶貴特性而廣為人知。由於其良好的生物相容性、生物降解性和親水性，HA通常被用作傷口敷料的生物材料【18】。

在豬傷口癒合模型中（圖2和圖3），HA與ASC-EXOs的聯合治療相比僅使用HA顯示出幾個有利的結果。首先，聯合治療導致了更高的傷口閉合率，顯示出改善的癒合效率。此外，聯合治療還減少了炎症並增加了再上皮化，進一步支持其有益效果。此外，HA與ASC-EXOs的聯合治療顯示出膠原蛋白III的增加，而膠原蛋白I和膠原纖維未顯示出顯著變化。這一變化表明I型與III型膠原蛋白的比率降低，這與無疤傷口癒合有關。儘管無疤胎兒傷口癒合的具體機制和分子信號尚未完全了解，但人們普遍認識到，增加的HA水平、減少的炎症以及I/III膠原蛋白比率的改變是無疤傷口癒合的特徵，相較於成人傷口的疤痕形成【23】。

綜合來看，這些發現表明，HA與ASC-EXOs的結合，在這一豬傷口癒合模型中促進了相對於單獨使用HA的更少疤痕的傷口癒合的巨大潛力。此外，HA通常被用作美容手術中填充劑的成分，以應對皺紋和增強皮膚的體積【17】。

近期研究為HA的持久填充效果的機制提供了見解，顯示其能激活成纖維細胞，並促進有效的膠原蛋白產生和ECM形成【17】。在小鼠皮膚填充模型中，HA與ASC-EXOs的聯合治療導致組織層變厚、血管化增加、膠原蛋白III的水平上升、膠原纖維沉積增加以及肌成纖維細胞的浸潤增強（圖4）。這些發現共同支持了這一觀點，即添加ASC-EXOs有助於通過激活成纖維細胞和促進血管生成來增強組織再生。

重要的是，ASC-EXOs在豬和小鼠模型中的體內實驗中未顯示出任何毒性或不良影響。這些觀察表明，將ASC-EXOs納入基於HA的治療方案中，對於增強傷口癒合和組織再生過程具有前景，並提供了超越僅使用HA的額外好處。

外泌體在細胞間通訊中發揮著重要作用，並在皮膚和骨骼再生以及心臟功能恢復等各個領域顯示出治療效果。然而，由於目標能力低和在循環中半衰期短等挑戰，其臨床應用受到限制【24】【25】。

為了克服這些限制，研究人員開發了生物可降解、或高多孔的水凝膠作為外泌體的遞送系統，從而實現持續的治療效果【24】。基於HA的水凝膠作為ECM的重要組成部分和常用的傷口敷料及皮膚填充劑，已被用作外泌體的遞送系統【22】【24】【25】。

這些水凝膠保護外泌體免受降解，延長其生物活性，並對傷口癒合和骨再生顯示出良好的效果【22】【24】【25】。在我們的體內實驗中，HA與ASC-EXOs的聯合使用所觀察到的改善效果相比於僅使用ASC-EXOs的體外實驗，正是這些因素的結果。

基於HA的水凝膠作為ASC-EXOs的有效載體，增強了其穩定性並促進了其治療潛力。這些發現表明，HA與ASC-EXOs的結合在皮膚修復和再生的臨床和再生美容應用中具有潛力。通過解決外泌體遞送相關的挑戰，這一方法可能為改善這些領域的結果提供有價值的選擇。

傷口癒合的討論

皮膚中的傷口癒合，是一個複雜且高度調節的過程，涉及止血、炎症、增殖和重塑等不同階段。這些階段相互協作，以恢復皮膚的完整性和功能【11】。上皮化是增殖階段中的一個關鍵過程，對於傷口閉合至關重要。雖然表皮幹細胞和角質形成細胞在這一過程中扮演著重要角色，通過增殖和遷移來覆蓋傷口床，但上皮化並不僅僅由表皮細胞控制【11,26】。多種由免疫細胞和成纖維細胞分泌的促炎細胞因子和生長因子，對角質形成細胞和表皮幹細胞的調節起著重要作用，這需要這些細胞類型之間的複雜相互作用和交互作用，以協調有效且及時的傷口癒合反應【11,26】。成纖維細胞在傷口癒合中至關重要，因為它們分泌膠原蛋白，形成肉芽組織的基礎。肉芽組織促進血管生成，即形成新血管，這對於向癒合中的傷口供應液體、氧氣、營養和免疫細胞至關重要【11,26】。角質形成細胞、成纖維細胞、炎症細胞和表皮幹細胞之間的相互聯繫網絡對於實現成功的傷口閉合至關重要【11,26】。

在我們的體內傷口癒合模型中，HA與ASC-EXOs的聯合使用顯示出多個有利的結果：更高的再上皮化率和傷口閉合率、增高的膠原蛋白III和肉芽組織水平，以及炎症的減少（圖3）。此外，ASC-EXOs促進了細胞增殖、遷移和參與ECM重塑的基因表達（圖1）。值得注意的是，已有報導指出ASC-EXOs能激活表皮幹細胞，誘導角質形成細胞分化，並增強角質形成細胞的增殖、生存、遷移和膠原蛋白分泌【11】。這些發現共同突顯了ASC-EXOs對傷口癒合過程中至關重要的多種細胞類型的多面向影響，包括炎症、肉芽組織和上皮化。全面理解這些細胞組件及其調控因子之間的複雜相互作用對於揭示ASC-EXOs促進傷口癒合和組織再生的分子機制至關重要。此外，研究ASC-EXOs的蛋白質組分和RNA載荷對於理解外泌體介導的傷口癒合至關重要。

來自間充質幹細胞（MSC）的外泌體具有再生和抗炎特性，這可能歸因於其獨特的載荷，與其他細胞類型不同。調節外泌體載荷，如改變MSC來源的外泌體中miR-29a的表達，已顯示出抑制纖維化並增強成纖維細胞遷移和增殖的能力【27】。了解外泌體的可遺傳和不可遺傳成分可能有助於預測其在組織再生中的治療效果。闡明ASC-EXOs效應背後的複雜機制將有助於確定潛在的干預靶點，並促進更高效和成功的傷口癒合結果。

外泌體相較於具有複雜結構和相關安全問題的幹細胞，提供了一種更簡單的結構和無毒特性，這為開發各種健康狀況的新型無細胞治療方法提供了機會。目前，臨床試驗正在進行，以評估外泌體在癌症、I型糖尿病和炎症性腸病等疾病中的診斷和治療用途，這可能為理解人類反應和再生過程提供寶貴的見解【28】。重要的是，在臨床環境中反復靜脈注射MSC來源的外泌體並未報告任何毒性【291】。同樣，本研究在兩種不同物種的體內實驗中未觀察到ASC-EXOs的任何不良影響，支持了MSC來源外泌體的安全性。然而，在臨床試驗中進行詳細的跟進將對進一步驗證其安全性和有效性至關重要。

總之，這些結果為ASC-EXOs在傷口癒合和組織再生中的潛在治療和美容應用提供了重要見解。進一步的研究是必要的，以闡明ASC-EXOs介導的傷口癒合和組織再生的基本機制，以及評估其在臨床環境中的安全性和有效性。總體而言，本研究的發現表明，ASC-EXOs無論是單獨使用還、是與HA結合，均有潛力，用作「傷口癒合」和「組織再生」的創新療法，適用於各種臨床應用。

4. 材料與方法

4.1. 幹細胞（ASC）的培養與特徵化

由健康供體收集的人類脂肪組織由ExoCoBio Inc.（韓國首爾）提供，並經CHA大學醫學中心的機構審查委員會批准，符合韓國食品藥品安全部（MFDS）的指導方針。從脂肪組織中分離ASC，並以每平方厘米3000個細胞的密度，使用含10%胎牛血清（FBS）的MEM（Gibco, Grand Island, NY, USA）進行亞培養，在37°C和5% CO2的濕度環境中培養。細胞使用0.25%胰蛋白酶-EDTA（Gibco, Grand Island, NY, USA）解離，然後用Dulbecco磷酸緩衝鹽水（DPBS）（Gibco, Grand Island, NY, USA）清洗；第4代細胞庫儲存在液氮中。ASC的質量通過無菌檢測、支原體檢測、細胞活力、內毒素和病毒檢測進行評估，並根據國際細胞療法學會的標準對ASC進行表面標記表達和三系分化潛力的特徵化【30】。

4.2. ASC-EXO的分離與特徵化

為了獲得ASC調理培養基（CM），將一瓶ASC庫解凍並在T175培養瓶及一層或兩層的Cell Factory（Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA, USA）中以逐步增加的培養規模進行亞培養，直到第7代，在37°C和5% CO2下培養。在第7代時，以6000個細胞/平方厘米的密度將ASC播種在10層Cell Factory中，並在含10% FBS的MEM中培養至90%融合。在清洗ASC三次以去除FBS後，添加無血清和無酚紅的MEM，並在37°C和5% CO2下進一步培養24小時，然後收集ASC-CM。ASC-EXOs使用基於切向流過濾（TFF）的ExoSCRT™技術從ASC-CM中分離，具體方法如之前所述【31】。簡而言之，ASC-CM通過0.22微米聚醚砜膜過濾器（Merck Millipore, Billerica, MA, USA）過濾，然後使用500 kDa分子量截留過濾器進行TFF濃縮。將濃縮的ASC-CM進行適當體積的PBS透析，然後以小分裝的形式儲存在80°C的無菌聚丙烯管中以備後用。根據國際細胞外囊泡學會推薦的2018年細胞外囊泡研究最小信息（MISEV2018）進行ASC-EXOs的特徵化【32】。

4.3. 人類真皮成纖維細胞、細胞增殖與遷移

HDF從美國典型文化收藏（ATCC; Manassas, VA, USA）購買。HDF在Dulbecco修飾的Eagle培養基（DMEM; Gibco, Grand Island, NY, USA）中培養，並添加10% FBS和1%的青霉素/鏈黴素，在37°C和5% CO2下孵育。使用CCK-8試劑盒（Dojindo, Kumamoto, Japan）按照製造商的指示評估HDF的增殖。HDF被播種在48孔板中，密度為20,000個細胞/孔，培養24小時後，使用無血清培養基（1% FBS）或陽性對照（含10% FBS的完全生長培養基）處理ASC-EXOs，然後通過CCK-8檢測細胞增殖。使用微孔板讀取器在450 nm處測量吸光度。HDF的遷移通過使用Incucyte活細胞分析系統（Sartorius, Goettingen, Germany）的刮傷傷口癒合測試來測量。HDF在96孔板中培養至100%融合，按照製造商手冊進行測試。簡而言之，在孔的中間創建直線刮傷以去除細胞。然後，孔用DPBS清洗一次，並添加含或不含ASC-EXOs的無血清培養基或陽性對照（完全生長培養基）。標記孔板並放置在Incucyte中，以確保在相同位置拍攝圖像，並每小時監測細胞遷移進展。

4.4. 膠原蛋白產量的評估—PIP測試

使用PIP酶免疫分析試劑盒（Takara, Shiga, Japan）按照製造商的指示測量前膠原蛋白1型C肽（PIP）的產量。HDF被播種在24孔板中，並用ASC-EXOs在無血清培養基中處理或用陽性對照（完全生長培養基）處理24小時。使用微孔板分光光度計在450 nm處測量PIP含量。

4.5. 總RNA提取和實時定量RT-PCR

使用RNeasy試劑盒（Qiagen, Venlo, Netherlands）從用ASC-EXOs在無血清培養基或陽性對照（完全生長培養基）處理的HDF中提取總RNA，按照製造商的指示進行操作。純化的RNA重懸於無RNase的水中並使用光譜測定法定量。總RNA的分裝在提取後立即儲存在-80°C。對於反轉錄，使用1微克提取的RNA和PrimeScript反轉錄酶（Takara, Shiga, Japan），隨後進行實時定量逆轉錄聚合酶鏈反應（qRT-PCR），以定量編碼膠原蛋白I和III、α-SMA、hFGF2和彈性蛋白的基因mRNA表達。使用甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）作為內部對照以標準化基因表達水平。實時qRT-PCR反應使用1微升總cDNA、0.5微升每個引物和SYBR Green的RT-PCR試劑盒（KaPa Biosystems, Wilmington, MA, USA）按照製造商的協議進行（45個循環，包括在95°C下3分鐘、在95°C下3秒和在60°C下30秒）。每組引物的效率和特異性通過標準曲線和熔融曲線分析確認。具體引物如表1所示。

4.7. 在體豬傷口癒合實驗

所有程序均經Knotus（韓國仁川）動物照護與使用委員會（IACUC 19-KE-222）批准。購自CRONEX.CO., LTD（韓國首爾）的SPF微型豬（雄性，體重20公斤）。根據先前的描述，在豬模型上創建了一個30 mm x 30 mm的全層傷口【33】。將豬隨機分為兩組：（1）HA組，使用250微升的HA處理；（2）HA + ASC-EXO組，使用溶解在250微升HA中的ASC-EXOs（4.0 × 10¹⁰顆粒/mL）進行處理。這些處理在3週內共施用9次，或在5週內施用15次（每週三次）。術後，豬隻單獨飼養。傷口面積在第0、7、14、17和19天或延長實驗的第7、11、14、21、28和35天進行測量。研究結束時（3週或5週）收集包括傷口區域的皮膚組織進行組織學分析。傷口癒合率的計算公式為：傷口癒合率 = (W₀ - Wd) / W₀ × 100%，其中W₀為第0天的傷口面積，Wd為治療後第d天的傷口面積。

4.8. 在體小鼠皮膚填充劑實驗

所有程序均經慶熙大學醫學中心（韓國首爾）動物照護與使用委員會（IACUC 2019-018）批准。購自ORIENT BIO Inc.（韓國城南）的SPF SKH1無毛小鼠（6週齡，體重28–35克）。小鼠分為兩組：（1）HA組，使用200微升的HA處理；（2）HA + ASC-EXO組，使用溶解在200微升HA中的ASC-EXOs（1.4 × 10⁹顆粒/mL）進行處理。每種處理均以皮下方式注射到SKH1無毛小鼠的兩個背部部位，並在3週後收集移植的移植物進行組織學分析。

4.9. 組織學分析、免疫組織化學與免疫螢光染色

組織切片厚度為5微米，安裝在載玻片上進行組織學分析。使用H&E和Masson三色染色來可視化再生組織的病理變化和膠原蛋白形成。在免疫組織化學（IHC）中，脫蠟的切片用PBS清洗，並將內源性過氧化物酶活性抑制，通過浸入2%（v/v）過氧化氫中5分鐘來實現。抗原修復通過在檸檬酸鈉緩衝液中孵育30分鐘進行。用PBS沖洗後，在室溫下用1.5%山羊血清封閉切片30分鐘。然後，切片與抗膠原蛋白I（1:200; ab6308, Abcam, Cambridge, MA, USA）和抗膠原蛋白III（1:200; ab23445, Abcam, Cambridge, MA, USA）一抗孵育。使用DAB底物系統（DAKO, Glostrup, Denmark）進行IHC染色的發展。用光學顯微鏡（BX53; Olympus, Tokyo, Japan）觀察H&E、Masson三色染色和IHC染色的組織，並拍攝圖像。使用ImageJ 1.53k軟件（NIH, Bethesda, MD, USA）定量陽性染色區域的平均密度。對於免疫螢光（IF）染色，使用抗波狀蛋白（1:50; V4630, Sigma, St. Louis, MO, USA）或α-SMA（1:200; ab5694, Abcam, Cambridge, MA, USA）的一抗，然後與結合了Alexa Fluor 488或Alexa Fluor 546的同型特異性二抗（1:1000; Thermo Scientific, Carlsbad, CA, USA）進行孵育。切片隨後用4,6-二氨基-2-苯基吡啶（DAPI）孵育1分鐘以可視化細胞核。使用共聚焦顯微鏡（LSM700, Carl Zeiss, Jena, Germany）拍攝IF染色圖像。

4.10. 統計分析

使用GraphPad Prism 5軟件進行統計分析。當比較多於兩組具有一個條件的樣本時，使用單因子ANOVA；而在涉及多於兩個條件的比較時，使用雙因子ANOVA。在ANOVA分析後，對多重比較應用後續Bonferroni校正。顯著性水平設置為p＜0.05，統計上顯著性用以下方式表示：* p＜0.05，** p＜0.01，*** p＜0.001，**** p＜0.0001。至少三個獨立實驗的數據以平均值±標準差呈現。