外泌體(脂肪幹細胞)與微針聯合對抗皮膚老化：12週隨機研究

引言

臉部皮膚老化，會導致外觀逐漸變化，進而引發美容顧慮和心理社會困擾。皮膚老化是一種由外部和內部過程引起的複雜現象。外部過程源於外部刺激，包括由紫外線曝露引起的光損傷；而內部過程，則隨著時間推移，並受到遺傳背景的影響。這兩個過程均會導致皮膚發生各種變化，包括不規則的色素沉著、皺紋形成、乾燥、皮膚變薄、鬆弛和彈性降低。

• 皮膚老化的主要原因包括外部光損傷和內部遺傳因素
• 間充質幹細胞療法在抗老化中的潛力
• 脂肪幹細胞衍生外泌體的無細胞治療優勢
• 使用外泌體與微針療法聯合治療的療效研究

為了延緩上述由皮膚老化引起的表皮和真皮變化，已使用多種治療方法。特別是，最近的研究報告顯示，使用幹細胞療法（包括間充質幹細胞和脂肪衍生幹細胞）對皮膚老化具有良好的效果。間充質幹細胞具備自我更新能力，和分化為多種細胞類型的能力，在各種疾病和再生醫學中具有很大的潛在應用。

脂肪衍生幹細胞作為一種來源於脂肪組織的間充質幹細胞，與其他幹細胞相比，在可及性(取得較為容易)和豐富性方面具有明顯優勢，因此其潛在的臨床應用得到了積極研究。研究表明，脂肪衍生幹細胞在體內和體外，對於治療皮膚老化是有效的。旁分泌信號似乎在脂肪衍生幹細胞的抗老化效果中扮演著重要角色。

然而，由於某些研究中報告的潛在腫瘤形成性、低植入率和質量控制困難等原因，脂肪衍生幹細胞的廣泛臨床使用受到限制。外泌體是直徑約30-200奈米(nm)的球形細胞外囊泡，具有脂質雙層結構。

最近的研究表明，外泌體在「細胞間的通信」中起著關鍵作用，通過將「蛋白質」和「遺傳物質」從一個細胞轉移到另一個細胞來進行交流。間充質幹細胞釋放的外泌體，能夠介導針對目標細胞的旁分泌信號。研究顯示，間充質幹細胞衍生的外泌體，能夠保留間充質幹細胞的生物活性，這表明使用這些外泌體可以作為整個細胞療法的替代治療。

此外，最近的研究顯示，脂肪衍生幹細胞的治療效果，是通過脂肪組織幹細胞衍生的外泌體（ASCEs）來介導的。因此，ASCEs作為安全、有效的無細胞治療劑，正在出現，並可以克服幹細胞療法的限制。

基於脂肪衍生幹細胞的抗老化效果和外泌體的生物活性，假設使用ASCEs可能是一種安全有效的面部皮膚老化治療方法。因此，本研究旨在通過隨機、分側的臨床研究來檢驗人類ASCEs溶液（HACS）和微針療法對面部皮膚老化（皺紋、彈性、保濕和色素沉著）的影響。

2 | 材料與方法

2.1 | 研究設計

本研究是一項為期12週的前瞻性、隨機、分側比較研究，旨在評估將HACS與微針療法結合，應用於治療面部皮膚老化的臨床療效。該研究已獲得機構審查委員會的批准，並依據《赫爾辛基宣言》進行。所有參與者在入組前均提供了知情同意。

參與者每3週進行一次治療，共接受三次治療，並在最後一次干預後進行為期6週的隨訪。在每次治療中，HACS和微針療法應用於面部的一側，正常生理鹽水和微針療法應用於另一側作為對照。每半邊臉所施用的試劑是通過區塊隨機化隨機分配的，區塊大小為四。

本研究共招募28名面部皮膚老化的受試者。由於缺乏先前的數據進行效能分析，樣本大小根據可行性確定。年齡≥40歲的個體符合納入研究的條件。排除標準包括懷孕、疤痕疙瘩病史以及面部急性炎症或感染狀況。此外，在研究期間禁止同時使用可能影響效果評估的治療，例如化學和機械重塑、光 rejuvenation 和填充劑注射。

2.2 | 治療方案

每位參與者用溫和的肥皂清洗整個面部，並在治療前30分鐘塗抹含有局部麻醉劑的共熔混合物（EMLA®）膏（阿斯特捷利康），並進行遮蓋以達到局部麻醉的效果。接著，將2毫升的生理鹽水與一瓶ASCE+ Derma Signal皮膚再生凍乾瓶（SRLV）- S（ExoCoBio Inc. 圖1A）混合以製備HACS。

HACS將局部塗抹於面部的一側，然後進行深度1毫米的微針療法（Dr. Back 10 Story FN-1，Dongbang Medi-care，圖1B）。HACS的成分總結於表1。另一側面部則使用2毫升的生理鹽水，然後進行微針療法。

2.3 | 臨床評估

在每次訪問中，所有參與者都使用標準化的數位相機（EOS 600D，佳能）在相同的照明條件下拍攝照片，並在第3週、第6週和第12週使用全球美學改善量表（GAIS）評估面部皮膚老化的整體改善。兩位經過認證的皮膚科醫生通過分析照片來確定GAIS分數，並根據改善程度在5分制評分表上給予分數（1級 = 惡化，2級 = 未變化，3級 = 改善，4級 = 明顯改善，5級 = 非常明顯改善）。

此外，參與者在每次訪問中被要求報告不良事件，包括紅斑、水腫、出血點和疤痕，並進行身體檢查以確保安全。

2.4 | 儀器評估

使用非侵入性設備客觀評估治療效果。皮膚皺紋使用非接觸式高分辨率光學三維皮膚測量設備（PRIMOS Premium，Canfield Scientific）進行評估，該設備測量皮膚表面粗糙度。為評估皮膚皺紋分析以下參數：平均粗糙度（Ra）、粗糙度輪廓的最大高度（Rt）以及粗糙度的平均最大高度（Rz）。

皮膚彈性使用Cutometer MPA 580（Courage + Khazaka）進行評估。生物彈性（R7）計算為彈性恢復與總變形的比率，作為評估皮膚彈性的參數。皮膚水分使用Corneometer CM 825（Courage + Khazaka）進行測量。皮膚診斷成像系統（Mark-Vu，PSI PLUS Co. Ltd.）用於評估皮膚色素沉著，該系統基於在紫外光下分析圖像以確定黑色素指數。

2.5 | 組織病理學評估

使用2毫米的穿刺工具在基線和隨訪訪問中從四名參與者處獲取皮膚活檢樣本。樣本使用蘇木精和伊紅、馬松三色染色、Herovici、Verhoeff-van Gieson和膠體鐵進行染色。經過認證的病理學家獨立評估組織切片的組織病理學特徵，進行標準顯微鏡檢查。

2.6 | 統計分析

描述性統計以平均值 ± 標準差或基線數據的比例呈現。使用累積連結混合模型分析GAIS分數，該模型使用logit連結函數，包含固定因素的治療（HACS對照組）、時間（第3、6和12週）及其交互作用，並為每位參與者包含隨機截距。此外，線性混合效應模型用於分析皮膚的皺紋、彈性、水分和色素沉著，並將基線的平均百分比變化建模，固定因素為治療、時間及其交互作用，並在參與者層級包含隨機截距。p值 ＜0.05被認為具有統計學意義。所有統計分析均使用R軟體版本4.1.1（R統計計算基金會）進行。

3 | 結果

總共有28名個體參加了本研究，且所有人均完成研究。參與者的人口統計學和基線臨床特徵總結於表2。

3.1 | 整體改善的臨床評估

在研究期間，兩側面部的GAIS分數逐漸上升：一側接受了HACS與微針療法的結合治療（HACS側），另一側則接受了生理鹽水與微針療法的結合治療（對照側）（圖2）。然而，HACS側的面部皮膚老化整體改善比對照側更為明顯。

| 表2= 參與者的人口統計學和基線特徵。備註：持續變數的平均值 ± SD（範圍）；類別變數的N（%）。
縮寫：HACS，來源於人類脂肪組織幹細胞衍生的外泌體溶液；Ra，平均粗糙度；Rt，粗糙度輪廓的最大高度；Rz，粗糙度的平均最大高度。

兩種治療之間的差異在第3週不顯著（p = 0.202），但在第6週變得具有統計意義（p = 0.023）。在最後的隨訪訪問（第12週），13例（46%）在HACS側的GAIS分數為3，4例（14%）的分數為4，4例（14%）的分數為5；而對照側13例（46%）的分數為3，2例（7%）的分數為4，2例（7%）的分數為5。這些結果表明，在最終隨訪訪問（第12週）中，HACS側的面部皮膚老化改善顯著大於對照側（p = 0.005）。圖3顯示了基線和隨訪訪問的代表性案例照片。

3.2 | 皮膚皺紋的改善/Skin wrinkles

與基線相比，雙側的皮膚皺紋都有所改善，但HACS側的治療效果顯著高於對照側（圖4）。在最終隨訪訪問中，HACS側的Ra、Rt和Rz的平均百分比減少分別為12.4%、14.4%和13.4%。相比之下，對照側的減少分別為6.6%、6.8%和7.1%，顯示出兩種療法之間的統計學顯著差異（p = 0.031、0.008和0.007）。所有三個參數一致顯示HACS的應用對於治療皮膚皺紋是有效的。

3.3 | 皮膚彈性的改善/Skin elasticity

在每個評估時間點，HACS側的皮膚彈性相對於基線均顯著提高。相比之下，對照側在研究期間的皮膚彈性沒有顯著改善（圖5A）。在第12週，HACS側的皮膚彈性平均增加了11.3%，而對照側則減少了3.3%。這揭示了兩側之間的統計學顯著差異（p = 0.002）。

3.4 | 皮膚水分的改善/Skin elasticity

在治療期間，兩種療法均顯著提高了皮膚水分，與基線相比（圖5B）。特別是，HACS側的皮膚水分持續增加，直到第12週，在最後隨訪訪問時平均增加了6.5%。這一增幅顯著高於對照側在第12週的增幅4.5%（p = 0.037）。

3.5 | 皮膚色素沉著的改善/Melanin index

在研究期間，對照側的黑色素指數沒有顯著變化。相比之下，HACS側的黑色素指數從基線到第12週顯著下降（圖6）。在最終隨訪評估中，HACS側的黑色素指數平均減少了9.9%，對照側減少了1.0%，顯示出兩側之間的統計學顯著差異（p = 0.044）。

3.6 | 組織病理學評估

在最終隨訪訪問中，HACS側獲得的組織學標本顯示出，較基線更高的膠原蛋白和彈性纖維密度，以及粘液和新合成膠原蛋白的增加（圖7）。對照側也觀察到了類似的組織學變化模式，但這些變化不如HACS側明顯。

3.7 | 不良事件

在研究期間未觀察到任何嚴重的不良事件。在治療期間及之後觀察到暫時性紅斑、水腫和瘀點。然而，這些都是輕微症狀，並在1週內自動消失。沒有參與者出現任何永久性皮膚變化或疤痕形成。

4 | 討論

本研究證明了結合HACS應用和微針療法對面部皮膚老化的療效。根據臨床評估、各種皮膚老化跡象的客觀測量、和組織學變化的顯微評估結果，這種聯合療法的療效高於單獨的微針療法。此外，這兩種方法的結合是一種安全的治療，具有可耐受的不良反應。

衰老的分子機制尚未完全闡明；然而，廣泛認為自由基（包括反應性氧物種）所造成的累積損害，在此過程中起著重要作用。在皮膚老化過程中，氧化壓力激活轉錄因子，如核因子κB，這促使促炎細胞因子的表達，從而增加基質金屬蛋白酶（MMPs）的分泌。氧化壓力還激活轉錄因子活化蛋白1，這增加了MMPs的表達並降低了轉化生長因子β的表達。因此，膠原蛋白的降解增加而合成減少，這加速了皮膚的老化。

此外，氧化壓力會破壞端粒的正常環結構，並暴露出TTAGGG串聯重複序列，導致p53的激活，從而誘導增殖性衰老或凋亡。ASCEs能有效抑制皮膚老化的關鍵過程。與間充質幹細胞衍生的外泌體在各種器官系統中的抗氧化特性一致，有報導稱ASCEs通過減少反應性氧物種的產生來降低氧化壓力。

由間充質幹細胞產生的細胞外囊泡，富含抗氧化酶過氧化還原酶（PRDXs），而ASCEs則包含PRDXs，如PRDX1、PRDX4和PRDX6。ASCEs還能減少紫外線誘導的目標細胞凋亡，並抑制核因子κB通路，降低促炎細胞因子（如白介素-13、白介素-6、白介素-4、白介素-1β、腫瘤壞死因子α和干擾素γ）的表達。

此外，有報導指出，ASCEs可增加轉化生長因子β的表達，並降低MMPs的表達，包括MMP-1和MMP-3。因此，ASCEs促進成纖維細胞增殖和膠原蛋白合成，加速細胞外基質重塑，並增加真皮厚度。這些ASCEs的關鍵功能，可能促成了本研究中觀察到的皮膚皺紋和彈性的改善。

隨著皮膚老化，表皮屏障變得更加脆弱，受損後的恢復延遲。隨著年齡增長，主要脂質類別（包括神經酰胺）的水平在角質層中傾向於減少，導致分泌的層狀小體內容物顯著減少。角質層中脂質含量的減少，特別是神經酰胺的缺乏，似乎解釋了屏障功能的損害。因此，神經酰胺水平的恢復可以改善老化皮膚中改變的屏障功能。

此外，報導指出，ASCEs能誘導與皮膚屏障和脂質代謝相關基因的表達。特別是，ASCEs能在皮膚中誘導神經酰胺的去新合成，促進表皮層狀小體和層狀結構的形成。因此，這些外泌體的作用減少了經表皮水分流失，改善了角質層的水合作用，並恢復了表皮的屏障功能。

因此，本研究中觀察到的皮膚水分的改善可能與(外泌體ASCEs)的作用有關。皮膚老化，尤其是光老化，導致斑駁的色素沉著和日光性黑斑。這些過程似乎是由包括角質形成細胞、黑色素細胞、成纖維細胞和內皮細胞在內的多種細胞類型之間的交叉對話所介導。

最近的一項研究報導指出，核因子紅系2相關因子2（NRF2）的信號傳導改變可能是紫外線誘導皮膚色素沉著的原因。NRF2信號通路通過調節抗氧化和解毒酶的水平來降低氧化壓力。日光性黑斑和光損傷皮膚表現出NRF2的表達降低，而NRF2的激動劑能改善光損傷皮膚中的斑駁色素沉著。

這些發現表明，增強NRF2信號通路可能成為治療皮膚老化的一種有希望的策略。考慮到ASCEs已被報導能上調NRF2的表達並增強NRF2的核轉位，這些外泌體可能是治療光老化皮膚色素沉著的有用療法。

在本研究中，使用微針療法促進ASCE進入真皮。微針療法有效地通過在皮膚中創建通道，來促進經皮藥物遞送。許多研究表明，微針療法可以用作藥物遞送方法，傳遞大型分子和小型藥物。此外，微針療法誘導膠原蛋白合成，從而增強皮膚的年輕化效果。

這項技術通過創建微通道來產生控制的皮膚損傷，並對表皮的損害最小。此外，它刺激真皮層的傷口癒合過程，通過上調各種生長因子的表達（包括血管內皮生長因子、血小板衍生生長因子、成纖維生長因子和轉化生長因子β）誘導新生血管生成和新膠原生成。

因此，微針療法導致膠原蛋白和彈性纖維沉積的增加，這在臨床上表現為皮膚緊緻和皺紋減少。微針療法的這些年輕化效果可能與ASCEs的效果在本研究中相互協同。

本研究有幾個局限性。所有參與者的族群相同，參與者數量相對較少。隨訪期相對較短。更長的隨訪期和更多受試者的結果將提供更有用的臨床信息。

本研究還具有幾個優勢。據我們所知，這是第一項使用ASCEs治療面部皮膚老化的人體臨床研究。本研究的另一個優勢是其隨機分半面設計，這能防止潛在混雜因素的影響。

總之，本研究證明了HACS應用與微針療法聯合使用對治療面部皮膚老化的療效和安全性。此外，這些療法的結合對面部皮膚的年輕化提供了協同作用。然而，需要進行大規模的長期臨床研究，涉及不同族群的患者，以便將這些發現推廣到其他人群。